中国肉类食品综合研究中心、北京食品科学研究院的王琳、李宇轩、范维、李贺楠、高晓月、陈淑敏从15份市售冷却肉中分离假单胞菌并对其进行鉴定，利用微孔板法测定菌株黏附能力，研究冷却肉中假单胞菌的类型及黏附能力，并研究金银花提取物对假单胞菌黏附能力的影响。

冷却肉中假单胞菌的鉴定

将显色培养基上呈现蓝绿色的菌落进行氧化酶实验和革兰氏染色。结果表明，氧化酶实验呈阳性的革兰氏阴性杆菌共46株，16SrDNA鉴定结果均为假单胞菌属。假单胞菌属中的不同种间相似性较大，简单的生理生化和16SrDNA鉴定难以确定菌株所属的种。VITEK2Compact全自动微生物鉴定系统是根据生化反应结果与库中标准菌株进行比对。46株假单胞菌中包括恶臭假单胞菌22株，占47.8%；荧光假单胞菌10株，占21.7%；浅黄假单胞菌8株，占17.4%；铜绿假单胞菌6株，占13.0%。VITEK2鉴定结果是由仪器根据生化反应的真实性作出判断，菌株的实测生化反应与假单胞菌属的典型反应符合度均在85%以上，结果可信度较高。

冷却肉中假单胞菌的黏附能力测定结果

46株假单胞菌中，33株具有黏附能力，占71.7%。根据鉴定结果将菌株以菌种名称+菌株编号命名。具有黏附能力的33株假单胞菌中，恶臭假单胞菌共17株，具有强黏附能力的3株为Pse.putida2-4、Pse.putida3-7、Pse.putida5-3；浅黄假单胞菌共5株，具有强黏附能力的2株为Pse.luteola8-4、Pse.luteola7-6；铜绿假单胞菌共4株，仅1株（Pse.aeruginosa5-1）具有强黏附能力；荧光假单胞菌共7株，具有强黏附能力的2株为Pse.fluorescens3-2、Pse.fluorescens10-3。从4种类型假单胞菌中各选择1株用于后续研究。恶臭假单胞菌对黏附能力贡献最大，后期应重点对其进行研究。

金银花提取物对假单胞菌黏附能力的影响

冷却肉中的假单胞菌对金银花提取物均具有敏感性。质量浓度12.5mg/mL金银花提取物可以很好地抑制Pse.luteola8-4和Pse.aeruginosa5-1生长，质量浓度25mg/mL金银花提取物能抑制4种假单胞菌生长，金银花提取物对Pse.luteola8-4和Pse.aeruginosa5-1的MIC为12.5mg/mL，对Pse.putida5-3和Pse.fluorescens3-2的MIC为25mg/mL。金银花提取物对Pse.putida5-3和Pse.aeruginosa5-1的MBC为50mg/mL，对Pse.luteola8-4和Pse.fluorescens3-2的MBC为25mg/mL。因此，一定质量浓度的金银花提取物对4种假单胞菌具有杀菌抑制效果。

随着金银花提取物质量浓度的增加，冷却肉中4种假单胞菌的RU均逐渐降低。在金银花提取物质量浓度为MIC时，其对Pse.putida5-3和Pse.aeruginosa5-1的清除率均高于80%，且金银花提取物对Pse.putida5-3和Pse.aeruginosa5-1的作用效果强于Pse.luteola8-4和Pse.fluorescens3-2。

荧光显微镜法观察金银花提取物对假单胞菌生物被膜的作用

未添加金银花提取物的TSB培养基中生长的菌体堆积形成褶皱、沟壑状立体结构；随着金银花提取物质量浓度增加，荧光图像通透性增加，表现为沟壑状结构消失，褶皱逐渐减少。图像明显变亮表明多糖黏附量增加，因此，金银花提取物能够降低冷却肉中假单胞菌的黏附能力。

在高于金银花提取物对Pse.putida5-3的MIC时，金银花提取物对Pse.putida5-3的作用主要是通过抑制菌体生长而降低菌体黏附能力；在低于金银花提取物对Pse.putida5-3的MIC时，金银花提取物质量浓度降低导致菌体黏连堆积而成的结构立体性增强。金银花提取物对Pse.aeruginosa5-1的作用效果也具有相似规律，高质量浓度金银花提取物抑制菌体生长，随金银花提取物质量浓度降低，其对菌体的抑制作用减弱。从MIC（12.5mg/mL）开始，金银花提取物的作用体现在影响Pse.aeruginosa5-1黏连堆积形成的立体结构，对菌体生长的抑制效果较微弱。菌体能够黏连堆积主要是由于多糖的存在，而金银花提取物的主要功能性成分是绿原酸等多糖，因此能够产生相似相溶作用，导致胞外多糖分布均匀度降低、改变胞外多糖通透性，从而减少菌体黏附聚集，降低黏附能力。

结论

鉴定冷却肉中恶臭假单胞菌、铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌和浅黄假单胞菌等46株菌，通过临界OD值法确定具有黏附能力的菌株占总数的71.7%，具有强黏附能力的菌株占总数的17.4%，其中恶臭假单胞菌黏附能力最强，能够为冷却肉保鲜提供理论支持。本研究结果证明金银花提取物可明显降低Pse.putida5-3和Pse.aeruginosa5-1的黏附能力，其作用效果与金银花提取物质量浓度有关，并从表观成像的角度阐释金银花提取物影响假单胞菌黏附能力的作用机制，为研究开发应用于肉制品保鲜的植物资源提供新思路。

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